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瞿元元副主任醫(yī)師 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院 泌尿外科 約5%的尿路上皮癌患者初診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移；30%的早期患者雖經(jīng)積極治療，但仍出現(xiàn)復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。晚期患者中位生存期僅為一年左右，現(xiàn)有的一些療法在延長生存期、減少復發(fā)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)了“瓶頸”，針對這一難題復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院葉定位教授領銜團隊開展卡瑞利珠單抗聯(lián)合蘋果酸法米替尼治療尿路上皮癌（UC）多中心、開放、單臂Ⅱ期研究，相關研究成果近日在線發(fā)表于腫瘤免疫治療學會官方期刊《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，影響因子：13.751。復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科瞿元元醫(yī)生為本文第一作者。2022年05月21日
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王文營主任醫(yī)師 北京友誼醫(yī)院 泌尿外科 原發(fā)性高草酸尿癥（Primary Hyperoxaluria, PH）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，以肝臟乙醛酸代謝相關酶異常所致的草酸鈣腎結(jié)石病、腎鈣質(zhì)沉著為主要臨床特征。PH全世界范圍內(nèi)發(fā)病率為1:1000000~3:1000000，但研究表明可能存在大量潛在患者。目前已知共有3種類型的PH，PH1是最常見和最嚴重的一型，是由編碼乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Glyoxylate Amino-transferase, AGT）的AGXT基因突變引起的，大約80%的PH患者是1型，其他還包括由編碼乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶（Glyoxylate/Hydroxypyruvate Reductase, GRHPR）的GRHPR基因突變導致的PH2和由編碼4-羥基-2氧化戊二酸醛縮酶1（4-Hydroxy-2-Oxoglutarate Aldolase 1,HOGA1）的HOGA1基因突變導致的PH。PH患者最典型的臨床癥狀就是早期發(fā)作腎結(jié)石病，腎鈣質(zhì)沉著和進行性腎功能損害，而且晚期腎功能嚴重損害患者由于大量草酸無法通過腎臟排出，會導致包括皮膚、心臟、骨骼在內(nèi)的多種器官草酸沉積，又稱系統(tǒng)性草酸沉積癥，常常引發(fā)一系列嚴重并發(fā)癥。所有PH中以PH1最為嚴重，超過50%的PH1患者最終會進展為腎衰竭，28%的PH1患者甚至在15歲之前就不得不接受透析治療。 如何有效降低PH患者血漿和尿液草酸濃度，減緩患者腎功能損害是治療PH的關鍵。時至今日，PH治療方式仍十分有限，藥物和肝移植等傳統(tǒng)治療方法雖然能夠減緩疾病進展，減輕患者癥狀，但效果有限。近年來也出現(xiàn)了新的療法來治療PH，其中核糖核酸干擾（Ribonucleic Acid interference, RNAi）療法已經(jīng)取得突破性進展，以其為基礎研發(fā)的用于治療PH1的藥物lumasiran已被美國和歐盟等國家正式獲批上市。此外，基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展讓我們看到未來徹底治愈PH甚至是多數(shù)單基因遺傳病的希望。 一.PH的傳統(tǒng)治療方式 維生素b6的早期服用和器官移植是PH的最傳統(tǒng)治療方法。維生素B6主要通過協(xié)助AGT運輸?shù)秸_部位來達到治療目的，維生素B6治療PH的歷史已經(jīng)超過40年，早期研究認為只有G170R、I244T以及F152I等突變對維生素B6治療敏感，但目前有報道AGXT基因多突變患者（A186V、R197Q以及I340M）也對維生素B6敏感，也有學者認為理論上大多數(shù)PH1患者都對維生素B6敏感。此外，有學者發(fā)現(xiàn)地喹氯銨、莫能菌素等在體外實驗中具有和維生素B6相同的藥理作用，但是目前并沒有相關的人體試驗數(shù)據(jù)，也并不清楚這些藥物能否用于治療PH。 對于PH患者，更為直接的治療方式是器官移植，特別是對于處于腎衰期PH患者，器官移植幾乎成為唯一選擇。由于PH主要是肝臟相關酶缺陷導致腎臟損害為主要特征，所以目前主要的器官移植方式包括聯(lián)合肝腎移植（Combined Liver-kidney Transplantation, CLKT）、次序肝腎移植（Sequentially Liver-kidney Transplantation, SLKT）、單純性腎移植（isolated Kidney Transplantation, KT）以及預防性肝移植（Pre-emptive Liver Transplantation, PLT）?，F(xiàn)行歐洲指南支持對ESRD期的PH患者行CLKT以及對于對維生素B6治療敏感的PH患者行KT，并不贊成常規(guī)進行PLT。最近，Metry等對過去45年內(nèi)總計1201例接受器官移植手術(shù)的PH患者進行了預后分析，結(jié)果顯示CLKT與SLKT兩種方式移植的患者預后并沒有顯著差異（10年生存率均為75.8%）；此外，雖然CLKT患者與KT患者術(shù)后15年生存率也沒有體現(xiàn)出明顯差異（分別為78%和60%），但兩者移植腎的10年存活率差異十分顯著（CLKT患者為87%，而KT患者僅為14%），他們的研究結(jié)果與指南推薦基本一致，CLKT和SLKT仍然是治療腎衰期PH1患者的首選。也有學者認為PLT對于非腎衰PH1患者也是個不錯的選擇。雖然器官移植手術(shù)能夠很大程度上改善PH患者預后，但供體緊缺、術(shù)后死亡率高以及長期服用抗排異藥物等不利因素限制了器官移植手術(shù)的開展。 二．PH的新興治療方式 1. RNAi療法 近年來，隨著基因分子技術(shù)的發(fā)展，特別是1998年發(fā)現(xiàn)RNAi之后，以其為基礎通過構(gòu)建小干擾核糖核酸（small interfering Ribonucleic Acid, siRNA）來沉默特殊基因成為治療眾多疑難雜癥的新思路，尤其是在發(fā)現(xiàn)N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine, GalNAc）等高效運載體之后，利用其對肝細胞高表達唾液糖蛋白受體1的高親和力，可實現(xiàn)GalNAc-siRNA共軛雙鏈到肝臟的靶向運輸，這促進了許多以肝臟為原發(fā)病灶的RNAi療法藥物的研發(fā)，其中就包括多種治療PH的藥物。Alnylam 制藥公司是進入RNAi治療領域中最早也是目前最具影響力的公司之一，該公司擁有RNAi療法核心專利，以其為基礎開發(fā)的許多藥物已獲批上市，其中就包括治療PH1的lumasiran。針對PH，目前主要確定了三個靶基因，分別是編碼乙醛酸氧化酶（Glycolate Oxidase,GO）的含氧酸氧化酶1（Hydroxyacid Oxidase 1,HAO1）基因、編碼乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)的LDH基因以及編碼羥脯氨酸脫氫酶（Hyroxyproline Dehydrogenase, HYPDH）的脯氨酸脫氫酶2（Proline Dehydrogenase 2,PRODH2）基因，沉默基因表達，從源頭上抑制草酸生成，降低尿液草酸濃度，延緩腎損傷進程。 (1).以HAO1基因為靶點 HAO1基因編碼的GO可將乙醇酸氧化為乙醛酸，PH1患者體內(nèi)由于缺乏AGT，乙醛酸無法被其轉(zhuǎn)化為甘氨酸，導致乙醛酸大量堆積，進而被LDH氧化為草酸，形成高草酸尿，若能抑制HAO1基因的表達，減少乙醛酸生成，便能有效減少尿液中草酸的濃度，緩解PH1的進展。動物實驗表明GalNAc-HAO1 siRNA通過沉默實驗動物體內(nèi)HAO1基因可以降低包括小鼠、大鼠和非人靈掌類動物（Non-Human Primates,NHPs）在內(nèi)的多種實驗動物模型的尿液和血漿的草酸濃度，以4mg/kg劑量給藥可降解NHPs體內(nèi)99%的目標mRNA，而且在高草酸尿小鼠模型中，98%小鼠經(jīng)過每周四次GalNAc-HAO1 siRNA治療后尿草酸水平都恢復正常。盡管不同物種的乙醛酸代謝會有一些差異，但人體肝臟每天通過GO氧化乙醇酸生成至少1000mg乙醛酸，這表明GalNAc-HAO1 siRNA在治療人類PH1上有巨大潛力。 Frishberg等進行的臨床試驗首次證明了GalNAc-HAO1 siRNA療法的有效性和安全性，經(jīng)過治療后所有PH1患者尿液草酸含量都已達到正常或者接近正常水平，且無論是健康受試者還是患者均未出現(xiàn)明顯不良反應。而且研究發(fā)現(xiàn)治療存在明顯的劑量依賴效應，每月給藥劑量為3mg/kg的患者24小時尿草酸排泄量下降最快，這些受試者GalNAc-HAO1 siRNA也表現(xiàn)出持續(xù)降低尿液草酸的效應[12]。此后，Garrelfs等納入來自8個國家的總計39位PH1患者進行3期雙盲臨床試驗，他們的試驗結(jié)果進一步證明了GalNAc-HAO1 siRNA療法的有效性和安全性，84%的試驗組患者24小時尿草酸排泄量不超過正常值的1.5倍，52%的試驗組患者24小時尿草酸排泄量達到了正常水平，與之相比，對照組占比均為0%。而且在整個治療過程中并未出現(xiàn)嚴重的不良反應事件，最常見不良反應為注射部位的反應，如紅斑、疼痛、瘙癢、不適等，都是輕微短暫的，并沒有導致治療終止。即使是在HAO1基因突變導致GO缺失的個體中，也僅觀察到明顯乙醇酸尿癥，并未出現(xiàn)其他嚴重癥狀，這也證實了GalNAc-HAO1 siRNA療法的安全性。2020年11月19日，以GalNAc-HAO1 siRNA為基礎開發(fā)的藥物lumasiran在歐盟首次被批準可用于全年齡段PH1的治療，同年11月23日，美國也批準lumasiran用于PH1的治療。歐盟和美國的指南推薦治療方案主要根據(jù)患者體重而定，起始每月一次負荷劑量，連續(xù)給藥三個月，然后以維持劑量持續(xù)給藥治療，體重小于10kg的患者負荷劑量為6mg/kg，隨后每月一次維持劑量（3mg/kg）；體重為10~20kg患者負荷劑量為6mg/kg，隨后每3個月給一次維持劑量（6mg/kg）；體重大于20kg者負荷劑量為3mg/kg，隨后每3個月給一次維持劑量（3mg/kg）。 (2).以LDH基因為靶點 LDH幾乎存在于人體的每一種細胞中，主要調(diào)節(jié)細胞內(nèi)乳酸和丙酮酸以及乙醛酸和草酸的動態(tài)平衡。LDHA基因編碼的M亞基和LDHB基因編碼的H亞基是構(gòu)成LDH的最常見亞基，這兩種亞基可以組裝成5個不同的四聚體即LDH的5種同工酶。LDHA主要在肝和肌肉組織中表達，LDHB則在心、腦、腎等多種組織中表達。LDH5是肝內(nèi)催化乙醛酸生成草酸的關鍵酶，若能直接沉默LDHA基因，降低LDH5濃度，就能大大減少肝內(nèi)草酸生成，有效治療PH，且可能對3型PH均有效。Lai等通過特殊小鼠模型證明了LDH在草酸代謝中的關鍵作用，在嵌合人類肝細胞的小鼠模型（80%肝細胞為人類肝細胞）中，GalNAc-LDHA siRNA對LDHA基因的抑制率超過了50%。Wood等動物實驗發(fā)現(xiàn)給正常小鼠注射GalNAc-LDHA siRNA并不會導致其24小時尿液草酸排泄量出現(xiàn)明顯的變化，但敲除AGT基因和GRHPR基因的小鼠的尿草酸排泄量下降卻表現(xiàn)得十分明顯，分別下降了75%和32%，而且動物實驗也并未發(fā)現(xiàn)GalNAc-LDHA siRNA會導致明顯的肝功能異常，即使抑制了LDH5的表達，小鼠也并未出現(xiàn)乳酸酸中毒的表現(xiàn)。 隨后，為驗證以GalNAc-LDHA siRNA為基礎開發(fā)的藥物nedosiran對于PH1和PH2患者的有效性和安全性，Hoppe等進行了首次人體試驗，在整個治療期間11位PH1患者（73%）和1位PH2患者（33%）24小時草酸排泄量降低到正?；蚪咏Ｋ?；在整個治療后的觀察期，12位PH1患者（80%）和2位PH2患者（67%）24小時尿草酸排泄量降低到正?；蚪咏Ｋ剑宜麄儼l(fā)現(xiàn)在給藥劑量為160mg的亞組中，24小時尿液草酸排泄量達到或者接近正常水平的比例最高。在整個治療后觀察期，患者24小時尿草酸排泄率最大降幅為64%，達到最大降幅的平均時間為104.6天。本試驗中健康受試者并未出現(xiàn)明顯不良反應，他們體內(nèi)的血乳酸和丙酮酸水平與安慰劑受試者并無明顯差別；患者最常見不良反應為輕微短暫的注射點反應如紅斑、疼痛、瘙癢、不適等，還有7位患者出現(xiàn)的不良事件較為嚴重，但均不認為與nedosiran有關。目前世界范圍內(nèi)報道的14例LDHA無功能性突變患最常見的癥狀為勞累性肌肉疼痛和皮膚損害，他們并沒有出現(xiàn)急性肝損傷和肝功能異常表現(xiàn)，在休息狀態(tài)下他們與正常人體內(nèi)的血乳酸和丙酮酸水平也很相近，這說明人體還存在其他途徑來調(diào)節(jié)乳酸平衡，進一步證實了nedosiran的安全性。雖然nedosiran對于PH1和PH2患者效果顯著，但目前其對于PH3患者的療效卻不盡人意，最新臨床試驗結(jié)果顯示：在經(jīng)過超過3個月的治療之后，雖然PH3患者24小時尿液草酸含量有所下降，但并未達到試驗預期（降低30%以上）。除了通過抑制LDHA表達來降低LDH濃度外，直接抑制LDH活性也是個不錯的方法，以此為基礎的藥物stripentol目前已經(jīng)進入2期臨床試驗階段。 (3).以PRODH2基因為靶點 PRODH2也稱為HYPDH，主要催化體內(nèi)內(nèi)源性和食物來源的4-反式-L-脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-Proline,Hyp）分解，其產(chǎn)物是體內(nèi)乙醛酸池重要來源之一，正常人尿液中15%的草酸是由Hyp代謝而來，在PH1、PH2和PH3型病人中這個比例分別為18%、47%和33%，這也說明抑制HYPDH就能減少Hyp的代謝，減少草酸前體物質(zhì)的產(chǎn)生，可能對PH的3個亞型都有治療效果。Buchalski等對此進行了深入研究，他們分別構(gòu)建敲除PRODH2基因的小鼠模型、敲除PRODH2-GRHPR基因的小鼠模型以及敲除PRODH2-AGXT基因的小鼠模型。由于敲除HOGA1的小鼠并不會出現(xiàn)高草酸尿，因此無法通過動物實驗來推測抑制PRODH2基因?qū)τ赑H3的治療效果。他們的研究結(jié)果表明，在配合低草酸飲食的雙敲除小鼠模型（PRODH2-GRHPR或PRODH2-AGXT）中尿液中的草酸和乙醇酸減少了18%~30%，雖然尿草酸水平并沒有達到正常范圍，但是這對PH1和PH2型小鼠也有顯著改善，而且單敲除PRODH2基因的小鼠除了血漿和尿液中Hyp水平明顯升高外，其他表現(xiàn)與正常小鼠相似，并沒有出現(xiàn)明顯差異[22]。目前并沒有相關人體試驗數(shù)據(jù)，未來或許會開發(fā)出GalNAc-PRODH2 siRNA，給PH患者提供更多的治療選擇。 2.其他療法 RNAi療法可抑制草酸生成，增加草酸的降解也是個可以降低PH患者血漿和尿液草酸濃度的方法。目前發(fā)現(xiàn)食草酸桿菌是一種自然存在于小腸內(nèi)以草酸為能量來源的腸道菌群，而且在動物實驗中，有學者發(fā)現(xiàn)食草酸桿菌能夠激活小腸草酸轉(zhuǎn)運體，有效增加內(nèi)源性草酸的排泄，降低血漿和尿液草酸濃度。但是在Milliner等以食草酸桿菌為基礎開發(fā)的藥物進行的2/3期臨床試驗中，藥物組和安慰劑組血漿和尿液草酸濃度都有所下降，但兩者差別并沒有統(tǒng)計學意義。此外，ALLN-177作為一種特異性草酸脫羧酶，也可以增加小腸腔內(nèi)草酸的降解，Lingeman等人體試驗結(jié)果也表明ALLN-177能夠有效降低繼發(fā)性高草酸尿癥患者24小時尿液草酸排泄量，而且擁有良好耐受性，未來ALLN-177或許也能作為治療PH的輔助藥物而投入市場. 三．PH的未來治療方式 PH根本病因在于基因突變，如果能使用基因編輯技術(shù)從基因?qū)用嫘迯屯蛔儯湍軓氐赘纳苹颊唧w內(nèi)酶缺乏的情況，從根本上治愈PH。簡單來說，基因編輯主要是在活細胞中插入、移除或修改特定的DNA序列。作為目前最高效、最精確的基因編輯工具，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列及其相關蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9）系統(tǒng)可精準完成目標基因的插入、刪除以及替換?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)出的堿基編輯器，甚至可在不切斷DNA鏈的情況下完成不同堿基的精確轉(zhuǎn)換。CRISPR/Cas9技術(shù)的這些優(yōu)點表明其在單基因疾病的治療方面擁有巨大潛力。在醫(yī)學領域，很多學者正在研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于癌癥、艾滋病、PH以及其他單基因遺傳病的治療。 Zabaleta等以腺病毒為載體搭載CRISPR/Cas9成功敲除了PH1型小鼠模型50%~60%肝細胞的HAO1基因，導致小鼠體內(nèi)GO完全消失，尿液草酸濃度顯著下降。Zheng等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除PH1型小鼠體內(nèi)大約20%肝細胞的LDHA基因，導致LDH表達下降50%，尿液草酸含量顯著下降，腎鈣質(zhì)化明顯緩解。 Esteve等利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將具有治療作用的AGXT微小基因插入PH1患者誘導多能干細胞的AAVS1位點，待這些誘導多能干細胞分化為肝樣細胞后，其AGT表達水平顯著升高，這些經(jīng)過基因編輯的肝樣細胞可起到原為肝移植的作用，可克服器官移植領域的供體緊缺和免疫排斥等問題。目前由于技術(shù)、倫理等方面的原因，CRISPR/Cas9技術(shù)治療PH還停留在動物實驗階段，但基因編輯技術(shù)通過修改堿基恢復正?；蛐蛄幸驯挥糜谥委熺牋罴毎氀挺?地中海貧血等單基因病，臨床試驗結(jié)果顯示其效果良好，在經(jīng)過一年的治療后，基因編輯技術(shù)成功修改了兩位患者體內(nèi)大約80%的目標基因，患者血紅蛋白出現(xiàn)了持續(xù)性、實質(zhì)性的提高，該技術(shù)理論上也可用于同為單基因病的PH患者。 隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，PH等傳統(tǒng)意義上的難治性疾病正在逐步減少?；驕y序技術(shù)讓我們明確了PH以及大多數(shù)單基因疾病的具體病因，掌握了患者體內(nèi)代謝缺陷的具體通路，明確了治療靶點，以RNAi療法為代表的基因治療藥物對于PH治療的成功顯示出其在單基因疾病治療領域的巨大潛力。此外，雖然基因編輯技術(shù)目前還廣受爭議，其有效性和安全性還需進一步檢驗，但其在遺傳病治療領域的巨大潛力也是毋庸置疑的，隨著基因編輯技術(shù)的完善和發(fā)展，未來或可完全顛覆PH以及大多數(shù)單基因遺傳病的治療方式，徹底治愈此類疾病。2021年12月16日2291
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